来源：brainnews

高尔基染色法最早观察到形态千差万别的神经元，这为揭示大脑的细胞复杂性提供了首批关键线索。自那时起，人类对脑细胞类型的认知得到极大拓展；近年来，随着神经示踪、单细胞转录组解析与电镜成像等技术快速革新，相关认知仍呈指数级增长。借助上述技术，研究者得以从超大尺度、超高分辨率层面完整勾勒大脑的细胞图谱。但现有研究大多仅单独分析细胞某一类特征，尚不明确各类细胞特征之间的对应关联，而这类关联是细胞类型划分标准的核心依据。Patch-seq（膜片钳-单细胞转录组测序联合）技术将单细胞转录组图谱与其局部形态、电生理特征相关联，进一步完善了细胞分型标准。

近日，一项由美国艾伦脑科学研究所牵头、多家中美及瑞士机构共同参与的合作研究在Nature发表，研究基于Patch-seq数据划分出17种形态-电生理-转录组联合亚型，并构建多级分类模型，整合细胞分型结果与神经元完整形态，进而解析多模态特征间的关联规律。

01建立视觉皮层兴奋性神经元的多模态分类体系

研究通过Patch-seq同时获取小鼠视觉皮层兴奋性神经元的转录组、电生理和局部形态信息，共纳入1,528个细胞，其中689个细胞获得了可分析的树突重建结果（Fig. 1a）。与此同时，研究利用稀疏标记和fMOST全脑成像，完整重建了341个神经元的树突与轴突，并将其配准至Allen CCFv3，以确定每个神经元的投射靶区（Fig. 1b）。基于参考转录组分类，研究首先为Patch-seq细胞分配T-type，随后结合电生理和树突形态特征，在具有三种完整数据模态的细胞中定义了17种MET-type（Fig. 1c、e）。进一步地，研究利用两个数据集共享的树突和胞体特征建立形态学分类器，将Patch-seq中的MET-type映射到具有完整轴突投射信息的全神经元形态数据中（Fig. 1c、d）。不同MET-type主要分布在特定皮层层次或相邻层次，并表现出相应的树突结构、电生理响应和长程投射特征（Fig. 1f–i）。其中，L4/L5 IT和L5/L6 IT Car3具有相对广泛的长程投射，而L5 ET-1 Chrna6的投射范围较其他ET类型更有限（Fig. 1g、i）。

02解析IT类神经元的多模态特征与投射规律

研究首先从转录组、电生理和树突形态三个维度分析IT类神经元。不同T-type在转录组空间中呈现清晰分离，并大致遵循由浅层至深层的皮层层次变化；相比电生理特征，形态学特征能够形成更为明确的细胞分群（Fig. 2a–c）。多个相近的T-type被整合为同一MET-type，但L6 IT细胞被进一步划分为三种MET-type，L4 IT Rspo1和L6 IT Car3则与相应MET-type接近一一对应（Fig. 2d）。不同IT MET-type具有明显不同的树突形态和电生理特征。其中，L5 IT-2神经元的顶端树突簇较少，部分细胞具有较长的基底树突（Fig. 2e）。L2/3 IT神经元整体具有较高的基强度，而L5/L6 IT Car3神经元表现出更快的膜电位上升过程，并可在动作电位阈值以下出现明显的去极化“隆起”（Fig. 2f–i）。L5/L6 IT Car3还表现出独特的分子和形态特征：其离子通道表达模式不同于其他L6 IT类型，表达多种Trpc通道，同时缺少部分钙通道和钾通道相关基因；形态上则具有较小的顶端树突，并偏向胞体下方的白质方向延伸（Fig. 2j、k）。通过形态学分类器，研究将Patch-seq定义的IT MET-type映射至全神经元形态数据。不同预测MET-type不仅具有一致的树突特征，其局部轴突分布和长程投射模式也存在明显差异（Fig. 2l–p）。L2/3 IT和L4 IT主要稀疏投射至少数高级视觉区，且很少跨半球；L4/L5 IT则广泛投射至同侧端脑和对侧视觉皮层，平均联系9.33个靶区，超过一半的细胞具有对侧投射（Fig. 2q、r）。相比之下，L5 IT-2主要投射至同侧高级视觉区，而L5/L6 IT Car3的对侧投射强于同侧投射（Fig. 2r）。

03 ET、NP、CT及L6b神经元的多模态特征

研究从转录组、电生理和形态学三个维度分析L5 ET、L5 NP、L6 CT及L6b神经元。不同亚类在转录组空间中呈现相对独立的分布，其中L5 ET Chrna6形成单独的细胞群，并主要对应单一T-type（Fig. 3a–d）。不同MET-type具有明显的树突和电生理差异：L5 ET神经元具有粗大、成簇的顶端树突，L6 CT的顶端树突较短且缺少树突簇，而L5 NP的斜行树突较为稀疏（Fig. 3e）。L5 NP神经元具有更低的基强度、更高的输入电阻和更长的膜时间常数，表现出更高的兴奋性（Fig. 3f、g）。在L5 ET类型中，L5 ET-1 Chrna6和L5 ET-2通常不发生动作电位簇发，而许多L5 ET-3神经元可在刺激初期产生高频簇发；不同类型之间还存在离子通道基因表达差异（Fig. 3h–j）。全神经元形态分析进一步显示，不同MET-type具有不同的局部轴突和长程投射模式。L5 ET可投射至多个丘脑和中脑区域，其中L5 ET-1 Chrna6的投射靶区少于L5 ET-2；L6 CT主要投射至视觉丘脑核团，而L6b主要投射至同侧高级视觉区、前扣带区和压后皮层，并持续支配皮层L1（Fig. 3k–q）。进一步表明，ET、NP、CT和L6b神经元的转录组、形态、电生理与轴突投射特征能够在MET-type层面相互对应。

04转录组变化可预测神经元的电生理与形态特征

尽管同一MET-type中的神经元仍存在一定差异，研究发现这些差异并非相互独立。研究利用稀疏降秩回归，将少量高变基因压缩为潜在因子，并分别预测不同转录组亚类的电生理和形态学特征（Fig. 4a）。分析显示，电生理潜在因子主要与动作电位宽度、波谷深度及上升／下降速度比等特征相关；形态学潜在因子则主要对应顶端树突的大小与复杂度、胞体所在皮层深度，以及顶端树突与基底树突的重叠程度（Fig. 4b–g）。留出细胞与训练数据呈现相似关系，且模型在留出数据和交叉验证中的预测表现总体一致（Fig. 4b–h）。具体而言，在L2/3 IT神经元中，第一电生理潜在因子能够预测动作电位宽度，潜在因子越高，动作电位越窄；该因子还与VISal和VISpm投射相关的基因表达特征有关（Fig. 4i–k）。在L6b神经元中，第一电生理潜在因子与输入电阻及超极化电流刺激下的膜电位响应相关（Fig. 4l、m）。在L6 CT神经元中，第一形态学潜在因子能够预测顶端树突的最大路径距离，第二形态学潜在因子则能够预测胞体的皮层深度（Fig. 4n–p）。表明转录组内部的连续变化与神经元电生理和形态学表型变化相对应，可用于预测单个细胞的多模态特征。

04转录组相关变化与轴突投射特征相对应

由于全神经元形态数据缺少直接的转录组信息，研究利用Patch-seq数据建立的稀疏降秩回归模型，根据WNM神经元的树突形态估算转录组相关潜在因子，并进一步分析其与轴突特征的关系（Fig. 5a）。在L2/3 IT神经元中，形态学潜在因子M-LF-1与局部轴突的层次分布显著相关：潜在因子的变化对应轴突在L1与L2/3之间的不同支配模式（Fig. 5b、c）。在L4和L5 IT神经元中，较低的M-LF-2与更多L2/3轴突支配相关，而较高的M-LF-2则对应更多L1和上层L5支配；这一变化也与L4 IT、L5 IT-2及L4/L5 IT等MET-type的差异相对应（Fig. 5d、e）。潜在因子同样与长程轴突特征相关。L2/3 IT神经元的M-LF-1越高，其在视觉皮层区域中的轴突长度越长；L4和L5 IT神经元的M-LF-1则与完整轴突树的总长度呈正相关（Fig. 5f–i）。

06整合细胞特征与空间位置预测神经元投射靶区

研究进一步利用逻辑回归模型，将转录组相关的形态学潜在因子与神经元在VISp中的位置结合起来，预测单个神经元投射至不同脑区的概率（Fig. 6a–d）。在L4和L5 IT神经元中，类似L4 IT的潜在因子组合对应较低的整体投射概率，而类似L4/L5 IT的组合对应更高的皮层及皮层下投射概率；类似L5 IT-2的细胞投射至压后皮层的概率低于L4/L5 IT，但投射至尾状壳核的概率高于L4 IT（Fig. 6a）。投射概率还受到神经元空间位置的明显影响。位于VISp中央的L4和L5 IT神经元投射至多数皮层区域的概率较低，而位于VISp外侧或前部的细胞更可能投射至对侧VISp（Fig. 6b）。对于L5 ET神经元，皮层下投射主要受到潜在因子变化影响：投射至LGd-co的概率主要与M-LF-2相关，而投射至LP的概率同时受到M-LF-1和M-LF-2影响（Fig. 6c）。其皮层投射同样依赖VISp中的位置，且前部细胞更可能投射至尾状壳核和脑桥灰质（Fig. 6d）。在单细胞预测中，模型给出较高投射概率的区域通常也是该神经元实际到达的靶区，表明细胞的转录组相关形态特征与皮层位置可以共同解释投射靶区的差异。

07结论

本研究整合Patch-seq与全神经元形态数据，建立了包含17种兴奋性神经元MET-type的多模态分类体系，将转录组身份与电生理、树突形态及全脑轴突投射联系起来。研究表明，细胞类型内部的转录组连续变化与电生理和形态差异相对应，并进一步关联局部及长程轴突特征。其中，L5/L6 IT Car3和L5 ET-1 Chrna6在多种模态及投射模式上均表现出鲜明特征。最终，神经元的转录组相关特征与其在视觉皮层中的空间位置可共同预测特定投射靶区，为连接细胞分子身份与全脑神经环路提供了统一框架。需要注意的是，部分MET-type的WNM样本数量仍然有限，同一类型内部的轴突靶向也存在一定变异，未来仍需更大规模、细胞类型特异的WNM数据进一步验证这一整合分类体系。