还在用传统的切片染色来统计c-Fos吗？OUT！
2024-12-12
即刻早期基因（Immediate early genes，IEGs）是一类特殊的基因，它们在细胞受到外部刺激后，会短暂而迅速地被激活。这些基因在转录水平上做出响应，代表了一种长期的反应机制，且其激活不需要蛋白质的从头合成。IEGs在细胞生化改变与细胞最终对刺激发生特异性反应之间起着中介作用，它们不仅参与细胞的正常生长、分化过程，也参与细胞内信息传递过程和细胞的能量代谢过程。
c-Fos是即刻早期基因（IEGs）的一种，属于原癌基因，具有高度的保守性。当神经元受到刺激或激活时，c-Fos基因会被迅速诱导表达，编码的核蛋白Fos可以在神经元中富集表达。因此，c-Fos可以作为神经元激活的标记物，通过检测其表达水平，可以了解神经元的激活状态，进而研究神经元的兴奋性、突触传递以及神经精神性疾病的发生和发展。
优点：
1. 操作简单易上手
2. 数据处理对软硬件要求低
缺点：
1. 全脑统计工作量巨大，抗体消耗量大
2. 人工手动切片无法保证全脑数据完整性
3. 需人工对每张脑片进行脑图谱配准，误差较大
4. 通常为15-50 μm厚切片，无法保证数据的精准性
5. 无法精准配对细胞的空间位置
fMOST>>>c-Fos
全脑三维成像
fMOST全脑c-Fos成像流程图
案例1：
2024年8月，中国人民解放军总医院于生元/刘若卓团队在The Journal of Headache and Pain期刊发表了题为“Brain-wide mapping of c-Fos expression in nitroglycerin-induced models of migraine”的文章，该研究利用fMOST全脑成像揭示了慢性偏头痛模型（CMM）中多个脑区c-Fos阳性细胞的表达情况。
标记方法：小鼠在造模前一个月尾静脉注射rAAV-PHP.eB-c-Fos-EGFP病毒，该病毒可透过血脑屏障在脑组织中使cFos表达EGFP荧光蛋白，通过多次施加硝酸甘油诱发小鼠慢性偏头痛，进行最后一次偏头痛造模后2h进行取材，随后进行fMOST全脑成像并统计量化。
参考文献:https://doi.org/10.1186/s10194-024-01837-9
案例2：
2022年9月，空军军医大学武胜昔与西安交通大学第一附属医院赵艳团队在期刊Neurobiology of Stress发表题为“Brain-wide mapping of c-Fos expression with fluorescence micro-optical sectioning tomography in a chronic sleep deprivation mouse model”的研究论文。在本研究中，作者通过fMOST对睡眠剥夺模型小鼠进行全脑c-Fos阳性细胞定位。
参考文献:https://doi.org/10.1016/j.ynstr.2022.100478
标记方法：小鼠在造模前一个月尾静脉注射rAAV-PHP.eB-c-Fos-EGFP病毒，在14天的睡眠剥夺之后，14天后进行取材，随后进行fMOST全脑成像并统计量化。
优点：
1. 避免了整脑c-Fos染色的染色不均一
2. EGFP蛋白具有良好的稳定性，适用于各种样本处理方式
3. 该方案较适用于长期/慢性病理模型或多次施加刺激后研究特定脑区激活情况
缺点：
1. 需在刺激之前注射病毒，病毒表达周期会影响c-Fos表达量
2. 尾静脉注射需要一定熟练度，病毒实际注射量会影响表达量
标记方法：施加刺激后2h，小鼠进行正常取材，鼠脑进行整体免疫荧光染色、树脂包埋和fMOST三维成像。该方案同样适用于其他病理模型的特定脑区激活情况。
优点：
1. 操作相对简单易上手
2. 无需病毒注射或者药物诱导c-Fos的表达，常规正常造模即可
3. 较适合单次刺激或急性模型研究全脑c-Fos表达
缺点：
1. 需选择能够进行整体染色的c-Fos抗体，且抗体消耗量大
2. 染色时间长，且可能存在染色不均一，批次间差异较大
标记方法：将cFos-TRAP小鼠与Ai14小鼠（Ai系列均可）杂交产下Fos-CreERT2小鼠，在cFos关联事件前1h腹腔注射4-OHT（4-羟基他莫昔芬），事件结束后至少保证小鼠72小时不受干扰，随后择期进行取材、树脂包埋及fMOST三维成像。该方案同样适用于其他病理模型的特定脑区激活情况。
优点：
1. 腹腔注射可精准把控诱导时间，减少非刺激相关因素的影响
2. 操作简单，只需要腹腔注射即可
3. 该方案慢性/急性或单次/多次均适用
缺点：
1. 转基因老鼠昂贵
2. 因给药环节变量较多，需同时使用阳性对照小鼠，同期检测
参考文献
1.Xiao, Shaobo et al. “Brain-wide mapping of c-Fos expression in nitroglycerin-induced models of migraine.” The journal of headache and pain，21 Aug. 2024
2.Cai, Guohong et al. “Brain-wide mapping of c-Fos expression with fluorescence micro-optical sectioning tomography in a chronic sleep deprivation mouse model.” Neurobiology of stress，7 Aug. 2022
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所属分类：
学术进展
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