Theranostics:利用cryo-MOST实现肾积水与肾脏结构的自发荧光3D成像

2023-12-14

前言

骆清铭院士和龚辉教授带领MOST团队发明的显微光学切片断层成像系列技术(MOST/fMOST)作为介观尺度最精准的三维完整器官成像技术,已在神经机制、脑疾病、心脑血管疾病以及药理毒理等科学前沿领域研究中发挥重要作用,并带动了相关标记技术和大数据处理和解析技术的发展。

 

文献背景

肾积水是临床常见病,长期肾积水可能导致肾功能衰竭。不同的病因和严重程度的肾积水导致肾脏解剖结构改变并影响治疗方案的选择。原位观察肾积水分布和肾脏的解剖结构有助于选择治疗方法。超声、磁共振和CT在内的在体成像可直接观察肾脏的实时状态,但分辨率低;组织切片、结合透明化的光片成像等的离体成像,因肾脏切除和固定改变了肾积水和血液灌注状态。目前临床上缺乏获得肾积水的准确 3D 分布和肾脏介观解剖细节的技术。

2023年9月4日,MOST团队在Theranostics上发表题为“3D autofluorescence imaging of hydronephro-sis and renal anatomical structure using cryo-micro-optical sectioning tomography”的研究,研究采用在体冷冻固定(IVCF)方法来维持小鼠肾脏的体内形态和血管灌注状态,分别选择单侧输尿管梗阻(UUO)和db/db小鼠作为急性和慢性肾积水模型,进行微米分辨率的全肾冷冻MOST自发荧光成像,获得了小鼠肾积水分布,肾亚区、肾单元和肾血管的介观解剖结构变化,为理解肾积水的疾病发展提供了技术支撑。

本次研究是基于MOST团队于2022年7月在iScience上发表的冷冻显微光学切片断层扫描(cryo-MOST)技术(点击查看,文章具体内容),且利用cryo-MOST技术已实现了在低温下以亚微米体素分辨率,对正常小鼠的舌头、肾脏和脑以及心梗疾病模型鼠的心脏等完整器官进行了三维成像与重建。

 

 

 

 

研究结果

研究人员首先在无标记下对正常小鼠肾脏的自发荧光进行cryo-MOST成像,重建了肾脏3D结构,并对皮质、外髓质外条纹 (OSOM) 、外髓质内条纹 (ISOM)和内髓质 (IM)四个肾亚区分割(图1A-C)。与相比传统PAS染色相比结构清晰,血管、肾小管形态结构更加显著易于区分。同时,对选取肾脏中的4 × 1 × 1 mm3 进行3D渲染和结构重建(图1M),发现静脉和动脉成对存在,肾小管(绿色) 盘绕并延伸至髓质区域(图1M 黄色虚线框)。这些结果表明,cryo-MOST可以实现全肾的3D可视化,并能够以单细胞分辨率对多种解剖结构进行分析。

 

 

 图1 正常C57小鼠肾脏cryo-MOST成像及其与PAS染色组织学切片比较

 

传统冷冻固定主要是离体冷冻固定(EVCF),指肾脏取出后冷冻固定,可能出现液体流出,影响灌注状态和整体形状;小鼠存活时进行在体冷冻固定(IVCF)可维持肾脏原始状态。因此,研究人员以Micro-CT为对照,评估IVCF和EVCF对cryo-MOST 成像小鼠肾脏形态的影响(图2A)。结果显示IVCF 的cryo-MOST与 Micro-CT肾脏形态相似,体积、长宽厚度不变,而EVCF组肾脏部分变形(图2D);血管方面,EVCF组肾血管密度减少(图2B、C、F),表明 IVCF 更好地保留了肾脏血管的解剖形态。

 

图2 通过IVCF和EVCF进行cryo-MOST成像来评估活体小鼠肾脏形态保存

 

为评估cryo-MOST成像肾积水的可行性,首先测量了小鼠尿液的激发和发射矩阵荧光光谱,发现cryo-MOST可对530nm处的自发荧光进行成像(图3A)。然后,对模型组小鼠进行单侧输尿管梗阻(UUO)3天后成像,发现UUO肾脏体积增大,肾积水已扩展到ISOM并导致肾实质严重变形(图3B、M)。进一步分析显示UUO引起肾脏长度、肾盂前后径(APDRP)增加,肾实质(RP)厚度降低;ISOM和IM肾亚区显著变短(图3C)。对体积测量显示UUO组全肾体积、皮质和ISOM亚区体积增大,IM亚区萎缩(图3D)。有趣的是,尽管肾实质和ISOM的厚度减少,但体积却增加了,表明在UUO早期,这些区域是发生扩张而非萎缩。因此,2D 剖面图像中的传统长度测量无法准确反映 3D 体积变化。进一步对比肾单位形态(图3E-L),发现近曲小管(PCT,图3I黄色箭头)和亨利袢(图3K 白色箭头)在UUO中集中凸出,肾小管扩张,表明PCT和亨利袢更易出现肾积水。

 

图3 对照小鼠肾脏和单侧输尿管梗阻 (UUO) 小鼠肾脏的cryo-MOST 成像

 

而后对血管进行了3D重建和量化,形态学显示UUO肾脏靠近肾门的节段性血管萎缩(图4A),横截面减小且被拉长(图4B、D)。同时,发现皮质和IM肾亚区的功能性毛细血管密度显著降低(图4F),表明皮质和IM的微循环受损引起缺氧。因此,皮质和IM比OSOM更易出现肾积水,可能与功能毛细血管的稀疏相关。因此,cryo-MOST 成像可以为早期肾脏病变的诊断提供独特见解,并探索缺血和缺氧在肾脏疾病发展中的作用。

 

 

 

图4 对照小鼠肾脏UUO小鼠肾脏的肾血管的3D重建和量化

 

进一步利用15W的慢性自发肾积水db/db小鼠研究。cryo-MOST成像显示15W 模型组db/db和对照组db/m小鼠肾脏四个亚区可显著区分(图5A),肾积水表现在ISOM(图5B),导致肾实质、皮质和ISOM体积增大。对肾单位形态分析(图5D-K),肾小球形态和表面积显著增大、肾小管直径显著增大。与UUO不同的是,慢性肾积水模型肾小管未出现中央凸起(图5H-K),可能与两种模型病因和严重程度不同有关。表明cryo-MOST不仅可以有效地显示和分析db/db小鼠的自发性肾积水,还可以区分慢性和急性肾积水引起的不同类型的结构损伤。

 

图5 15W db/m和db/db小鼠肾脏的cryo-MOST 成像

 

进一步重建并量化肾血管网络,发现叶间血管存在少量变形,仅部分叶间血管肾积水区附近静脉横切面呈扁圆型(图6A、B);功能性毛细血管密度无差异。

 

 

图6 15W db/m和db/db小鼠肾脏肾血管的3D重建和量化

 

最后,探讨了 db/db 小鼠肾积水的原因。亚甲基蓝注射和压力测试,排除输尿管梗阻和尿道未阻塞后,但发现输尿管双侧压力显著降低(图7C-D),存在双侧膀胱输尿管反流。成像显示亚甲基蓝已回流到肾髓质(图7E)。利用排尿点分析 (VSA)实验验证膀胱异常(图7F-I),分析尿斑频率分布表明膀胱过度活动。因此db/db小鼠肾积水的形成和发展可能与膀胱输尿管反流和膀胱过度活跃有关。

 

 

图7 15W db/db小鼠的膀胱输尿管反流和膀胱过度活动

 

全文总结

在这项研究中,研究人员发现IVCF可以很好地保护肾脏的原位形态,而cryo-MOST在无标记的情况下利用自发荧光成像可以用于获得整个肾脏的三维图像,包括其体内灌注状态和微米分辨率。通过对UUO、db/db和对照小鼠肾脏进行冷冻MOST成像,我们不仅观察到积水肾的分布,还分析了多个肾脏结构的变化,包括肾亚区、动脉、静脉、肾小球、肾小管和功能性毛细血管。这些对积水肾及其对肾脏各种结构的影响的综合研究为理解病理学和预防疾病引起的损伤提供了科学依据。

 

全文链接:https://www.thno.org/v13p4885.htm

参考文献:

Fan G, Jiang C, Huang Z, Tian M, et al. 3D autofluorescence imaging of hydronephrosis and renal anatomical structure using cryo-micro-optical sectioning tomography. Theranostics 2023; 13(14):4885-4904. 

Deng L, Chen J, Li Y, et al. Cryo-fluorescence micro-optical sectioning tomography for volumetric imaging of various whole organs with subcellular resolution. iScience. 2022;25(8):104805. 

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