重要成果！PNAS：浙大/浙中医大陈忠教授团队绘制首个小鼠全脑组胺能神经元投射图谱
2023-03-31
骆清铭院士和龚辉教授带领MOST团队发明的显微光学切片断层成像系列技术（MOST/fMOST）作为介观尺度最精细的三维成像技术，伴随着各种标记技术和数据处理技术的发展，现已在神经机制研究、脑疾病研究、心血管疾病研究以及病理毒理等领域得到广泛应用。
组胺是哺乳动物大脑中的一种保守的神经调节剂，参与调节多种生理功能和病理过程。组胺能神经元是脑中组胺唯一的来源，仅位于下丘脑后侧的结节乳头核(TMN)，其轴突几乎可以投射到所有主要脑区。组胺很少通过突触传递，主要通过组胺能神经元轴突上的囊泡释放，并迅速与周围的组胺受体结合。因此，建立一个全面的组胺能神经元输出图谱，看清所有轴突纤维投射分布特征，将是组胺能神经元功能研究的一个重要里程碑。
以往的研究使用免疫组化技术探索了组胺能神经纤维在大鼠脑中的分布，但受到标记工具和成像技术的限制，这些研究还没有在三维水平上展示全脑组胺能神经元及其轴突纤维的分布。
2023年3月28日，浙江大学/浙江中医药大学陈忠教授研究组与华中科技大学MOST团队合作，在国际知名期刊PNAS发表了题为Whole-Brain Mapping of Histaminergic Projections in Mouse Brain 的研究论文。在本研究中，研究者利用组氨酸脱羧酶(HDC)-CreERT2小鼠和遗传标记策略，用荧光显微光学切片断层成像技术（fMOST）在0.32μm × 0.32μm × 2 μm像素分辨率下重建了首个组胺能神经元的全脑投射图谱，并量化了所有脑区组胺能神经纤维密度。通过稀疏标记，重建了60个单组胺能神经元的精细形态结构，揭示了个体组胺能神经元的高度异质性投射模式，为组胺能神经元功能探索提供了研究基础。
01 组胺能神经元的全脑可视化和定量研究
为了特异性标记整个鼠脑中对组胺能神经元，作者构建了HDC- CreERT2:Ai47小鼠，组胺能神经元将表达GFP蛋白。对全脑进行fMOST成像，并使用NeuroGPS系统以1μm x 1μm x 2μm像素分辨率测定下丘脑后侧切片中GFP阳性细胞的数量，然后通过手动校正精确地计算阳性细胞的数量。结果显示成年雄性小鼠大脑中有5000余个组胺能神经元，每个半球的标记神经元数量约为2500个，反映了组胺能神经元分布的对称性。同时证实了该转基因小鼠模型能够很好的标记组胺能神经元，可以用于神经投射图谱的绘制。
图1. 全脑组胺能神经元空间分布及定量分析
02 组胺能神经元轴突全脑投射图谱
由于Ai47小鼠中GFP主要表达在胞体中，要绘制全脑组胺能神经投射图谱，需要找到一种方法来清楚地标记组胺能神经元胞体和轴突。为此，作者选择了一种Cre依赖的AAV病毒载体，能够在组胺能神经元的胞体和轴突中表达明亮的GFP荧光蛋白，并且几乎在每个脑区都能观察到信号。随后通过fMOST进行全脑三维成像，以0.32μm × 0.32 μm×2 μm像素分辨率重建了首个标准量化的小鼠全脑组胺能神经投射图谱。由于组胺能神经元几乎将轴突纤维投射到所有脑区，因此很难描述它们的分布特征。为了解决这一难题，作者计算了所有脑区中组胺能神经元轴突纤维的密度，并根据荧光密度将它们分为密集、中等、稀疏三类。
图2. 构建全脑组胺能神经投射图谱
03 组胺释放与组胺能神经纤维密度相关性分析
为进一步探究组胺能神经纤维密度的生物学意义，作者在上述三组中分别选取了一个脑区进行功能关联性研究：密集组：内侧隔核（MS）、中等组：中央杏仁核（CeA）、稀疏组：海马CA3，并选取200μm x 200μm x 200μm的区域三维展示其纤维分布特征。然后，作者使用光遗传学技术进行了功能相关实验，发现组胺能神经纤维的密度与释放组胺量存在关联性。
图3. 不同荧光密度区域组胺能神经纤维细节展示
04 组胺能神经元的稀疏标记全脑三维重建
为研究单个组胺能神经元的投射模式，作者用稀疏标记结合fMOST技术追踪和重建了60个组胺能神经元。对其投射纤维进行了分支特性分析与投射方向分析，发现不同的组胺能神经元之间存在较大的投射差异。随后通过聚类分析进行系统性分类，结果显示组胺能神经元群体难以按照投射趋势自动被分类为不同的亚群，作者猜测这可能是不同组胺能神经元的投射方式互相差异过大导致的，提示分群理解需要其他特殊的方式。
图4. 60个组胺能神经元投射模式
05 组胺能神经元分支全脑投射模式
为了探索组胺能神经元投射群体的潜在分群模式，作者选择了MS和上丘(SC)脑区，它们都位于冠状面中线，且分别位于TMN前侧和后侧，组胺在这两个脑区中介导不同的功能。将带有不同荧光的AAV-retro病毒载体注射到这两个脑区，逆行示踪上游组胺能神经元，。进一步，重构60个单组胺能神经元验证分析，发现投射到MS与SC的组胺能神经元确实存在明显的分群，但胞体的空间位置分布并未发现明显的差异。
图5. MS和SC脑区60个单组胺能神经元投射模式
原文链接：
www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2216231120
2023
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